RNA-Seq実験については、GENEWIZでは1x50 bpシングルリード(SR)構成(遺伝子発現レベルの解析を伴うプロジェクト)、ならびに2x100 bpペアエンド(PE)構成(選択的スプライシング転写物といった新規アイソフォームの同定を伴うプロジェクト)を推奨しています。2x100 bp PE構成は、De Novo トランスクリプトームアセンブリを必要とするプロジェクトに対しても推奨されます。
また、GENEWIZはリファレンスを持たない配列に対し、De Novoトランスクリプトームアセンブリーもご提供しています。
カスタムデータ解析がご必要な場合は、RNA-Seq見積リクエストフォームの「プロジェクトに関する説明」セクションに解析要件を記してください。
GENEWIZ
Attn:NGS Laboratory
115 Corporate Boulevard
South Plainfield, NJ 07080
USA
海外からの発注:運送会社に傷みやすい品であることを通知してください。発送が完了した後、GENEWIZに追跡情報をお伝えください。海外発送では税関を通ることになるため、GENEWIZに再発送する必要性が生じた場合に備え、十分な量のサンプルを確保しておいてください。
はい。RNA-Seqプロジェクトにおいて、ds-cDNAを出発物質としてご利用になれます。ただしds-cDNAを用いる場合、完全な品質管理は不可能であることをご了承ください。その際、少なくとも1 µgのds-cDNA(濃度 50 ng/µl)が必要です。
totalRNAサンプルには以下の要件が適用されます。
GENEWIZでは、サンプルごとに一定のリード数の提供を保証をしています。目安として、Illumina HiSeq 2500のラピッドランモードでは1レーンあたり1億2,000万リード、高出力モードでは1レーンあたり2億5,000万リードの提供が保証されています。
GENEWIZでの作業の進捗状況は、サンプルの受領時、および品質管理結果の確認時に更新いたします。その後、GENEWIZはプロジェクトの全期間にわたって情報を毎週更新します。
raw hit countは、特定のゲノム機能(通常は遺伝子または転写物)に対してリード数を正確にカウントすることで算出します。
お客様の機密と知的財産(IP)の保護はGENEWIZの最優先事項です。GENEWIZ側で完了したあらゆるプロジェクトのセキュリティとプライバシーはしっかりと守られるのでご安心ください。詳しくは、GENEWIZの機密保持ポリシーをご覧ください。
全ゲノムシーケンシング
アセンブリープロセスの最中には、コンティグと呼ばれる、シーケンスリードの重複によって形成される大きなDNAシーケンスが生まれます。次世代シーケンシング(NGS)は、フラグメント化した核酸をシーケンシングすることで機能するため、コンティグ間にギャップが生じます。
次世代シーケンシングの用途のひとつであるターゲットリシーケンシングでは、シーケンシングにおいて関心のある領域にエンリッチメント(フォーカス)を行います。
全ゲノムのサイズは非常に大きくなることがあります。ターゲットリシーケンシングによって、詳細を知る必要のない領域を除外することで、初期ターゲットサイズを小さくできます。特定のNGSプラットフォームおよび構成の出力は一定であるため、ターゲットサイズが小さくなると、柔軟性をもってより多くのサンプルを同一のランに多重化したり、より深いカバレッジでシーケンシングを実施したりできようになります。
多重化能力が向上すると、より多くのサンプルを単一のランでシーケンシングできるようになるため、(サンプルあたりのコストが大幅に減って)プロジェクトの費用効果が高まります。カバレッジが深くなると、アッセイの感度も上がります。この高い感度によって、まれにしか発生しない低頻度の変異をより効果的に検出できるようになります。また、より複雑なゲノム領域(GCリッチまたはATリッチ領域など)の解決も可能となります。
エクソームシーケンシングは、ターゲットリシーケンシングの一種です。ただし、ターゲットサイズは大半のカスタムターゲットアッセイよりも大幅に大きいものとなります。そのため、全ゲノムシーケンシングと同様の効果を得られます。
ターゲットリシーケンシングには主に、ターゲットエンリッチメントとアンプリコンシーケンシングの2種類があります。ターゲットエンリッチメントでは、完全ゲノムライブラリーの作成に続き、ベイトを用いて関心部位をキャプチャします。これとは対照的に、アンプリコンシーケンシングでは高度に多重化されたPCR反応において、非フラグメント化ゲノムDNAの標的部位を直接増幅します。さらに、ターゲットエンリッチメントおよびアンプリコンシーケンシング技術は、各社(Illumina、Agilent、Life Technologiesなど)が設計したものを含めると数種類に及びます。
アッセイ設計プロセスは、比較的な単純なものから非常に複雑なものまでさまざまです。
設計プロセスに影響を及ぼす主な要素の例として、以下が挙げられます。
GENEWIZが持つターゲットアッセイ設計に関する幅広い経験は、特定の用途向けに自社開発された複数のパネル(がん研究用に最適化されたOncoGxOne™ディスカバリがんパネルなど)にも反映されています。
考えられる用途の一例として以下が挙げられます。
詳しくは、プロジェクトマネージャー(PM@genewiz.com)にお問い合わせください。
用途の一例として以下が挙げられます。
エクソームシーケンシングは、全ゲノムのおよそ1~2%を標的とするターゲットアプローチです。そのため、より多くのデータが生成され、深いカバレッジによって感度も向上しています。
がんパネルは、エクソームシーケンシングターゲットのごく一部を標的とします。そのためカバレッジは一層強化されており、非常にまれな変異さえも効果的に検出する感度を備えたアッセイができ上がります。(がんドライバーであることが多いことが示されている)体細胞変異は、非常に低い頻度でしか発生しない傾向があるため、これはがんの検出において欠かせない要素となります。
GENEWIZは主に以下の2種類のがんパネルを提供しています。
1.がんホットスポットパネル
2.OncoGxOne™ディスカバリがんパネル
TruSeqアンプリコンがんパネルおよびIon AmpliSeq™がんホットスポットパネルは、がんホットスポットパネルに分類されます。
がんホットスポットパネルは、突然変異ホットスポットとして入念に特性化された48~50の遺伝子から成る領域を標的としています。これは、これらの遺伝子のエクソン領域のごく一部となります。アッセイ対象の遺伝子は、さまざまな種類のがんにわたって共通のものとなっています。標的を定める工程には、アンプリコンシーケンシングと呼ばれる技術が用いられます。ここでは、設計済みのプライマーをハイブリッド化させ、高度に多重化されたPCR反応のもと、関心のある領域を非フラグメント化ゲノムDNAに隣接させます。がんホットスポットパネルにより、点変異や小さな挿入欠損に関する情報を入手できます。
OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、すべてのエクソン、すべてのUTR、そしておよそ150~400の遺伝子から成る転座切断点が判明しているイントロンを標的とします。遺伝子の正確な数は19種類あるパネルごとに異なります。それぞれのパネルは、個々の種類のがんに特有のものとなっています。この技術では、ターゲットエンリッチメントと呼ばれる、完全に準備されたゲノムライブラリーに対して、設計済みのビオチン化ベイトをハイブリッド化し、関心のある領域を引き出すという手法を用いて標的が定められます。OncoGxOne™ディスカバリがんパネルにより、点変異、挿入欠損、コピー数多型(CNV)、遺伝子融合に関する情報を入手できます。
これらの2種類のオプションには長所と短所があります。たとえば、OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは包括的な検出が可能ですが、データの生成に時間と費用がかかります。
当社の熟練プロジェクトマネージャーが、お客様の状況とプロジェクトについてお聞きしたうえで、最適な方法を特定するお手伝いをいたします。
主な特徴として以下が挙げられます。
OncoGxOne™ディスカバリがんパネル、ならびにがんホットスポットパネルの遺伝子リストについては、プロジェクトマネージャー(PM@genewiz.com)または現地の販売代理店までお問い合わせください。
どのプロジェクトにおいても、生データはFASTQファイル形式でお届けします。
がんホットスポットパネルを用いたプロジェクトについては、いただいたサンプル内に検出された点変異と挿入欠損に関する詳細レポートもお渡します。これは、すべてのプロジェクトに付属しています。
OncoGxOne™ディスカバリがんパネルについては、点変異、挿入欠損、コピー数多型(CNV)、遺伝子融合に関する詳細レポートもオプションでご提供します。
また、ご要望に応じてカスタムレポートもご利用になれます。その場合、フォームの「プロジェクトに関する説明」セクションにご希望の内容を記入してください。
他にもご質問がある場合は、電子メール(PM@genewiz.com)でお問い合わせください。当社の熟練プロジェクトマネージャーが誠意をもって対応いたします。
特別設計:既製のがんパネルは汎用的な遺伝子パネルであり、対象のがんの種類とは関係がない可能性のある遺伝子も多く含まれていますが、OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、それぞれが個々の種類のがんをアッセイするよう特別設計されています。
より包括的: 標準的なOncoGxOne™ディスカバリがんパネルにはおよそ250種類のがん遺伝子が含まれている一方、既製のものは50種類ほどにしか過ぎません。さらに、これらの50種類ほどの遺伝子は、対象のがんと関連がない可能性もあります。
GENEWIZ OncoGxOne™ディスカバリがんパネルは遺伝子のエクソン領域をアッセイしますが、ご要望に応じて特定のイントロン領域をアッセイすることも可能です。これとは対照的に、既製のがんパネルは一定数のホットスポットしかアッセイできません。
より多種のゲノム異常を検出: 当社独自のパネル設計とバイオインフォマティクス技法が組み込まれたOncoGxOne™ディスカバリがんパネルは、4種類すべてのゲノム変化(点変異、挿入欠損、遺伝子融合、コピー数多型(CNV))を検出できる一方、既製のがんパネルで検出されるのは点変異と挿入欠損に限定されています。
GENEWIZはターゲット配列のエンリッチメントにおいて、SureSelectプローブ型キャプチャアッセイを採用しています。データ生成にはMiSeq/HiSeqを使用しています。
エクソームシーケンシング
全ゲノムシーケンシングにおいては、たとえ中程度のカバレッジを実現するだけでも、極めて大量のシーケンシングスループットが必要となります。生成されるデータは包括的でありながらも、ターゲットアプローチと同等の感度をもってしても変異を検出することはできません。エクソームシーケンシングは現行のシーケンシング技術と併用することで、最も費用効果的かつ効率的なソリューションとなります。
重要な突然変異の大部分はエクソームで発生しています。実際に、疾患関連変異の85%はエクソームに含まれています。エクソームは全ゲノムの2%未満にしか過ぎないため、そのシーケンシングにおいては50分の1のスループットで通常のシーケンシングと同じカバレッジの深さを実現できます。エクソームシーケンシングでは低いシーケンシングスループットしか必要としないことから、柔軟な実験オプションを採用できます。
1. 同じ深さのカバレッジを維持しつつ、より多くのサンプルを同一のレーンに多重化することで、プロジェクトの総費用を大幅に削減できる
2. カバレッジの深さを高めて、まれにしか発生しない低頻度の突然変異の検出を促進する
3. 1と2の組み合わせ。
16S MetaVx™シーケンシング
現行の16Sメタゲノミクス技法は、単一のプライマーペアを用いて、16S rRNA遺伝子の超可変V4領域をターゲットにしています。16S MetaVx™では、独自のプライマー設計によってこの機能が改良されており、16S rRNA遺伝子の超可変V3、V4、V5領域をターゲットとすることができます。
16S MetaVx™による解析を現行の16Sメタゲノミクスと比較した場合、16S MetaVx™はより高い感度と特異性を発揮することで、数々のサンプルにわたり、一貫してより多くの細菌属 / 古細菌属を同定することができました。
また現行の16Sメタゲノミクス技法では、そのアンプリコン設計に起因するシーケンス多様性の低さに対処するため、15%以上のDNAスパイクインが必要ですが、これによって、かなりの量のシーケンシングスループットがオフターゲットのカバレッジへと分散してしまいます。一方16S MetaVx™はその独特な設計により、DNAスパイクインは不要であるため、シーケンシングスループットのすべてをターゲット領域にのみ当てることができます。